一、文章介绍

空间蛋白质组学技术近年来取得了长足进步，常规可同时对20余种靶标进行成像，极大克服了早期多重检测的限制。然而，检测灵敏度不足仍然是制约其广泛应用的关键瓶颈，特别是对于理解免疫反应和疾病机制至关重要的低丰度标志物。此外，现有方法在多模态整合方面存在明显局限——大多数信号扩增技术（如SABER、杂交链式反应、滚环扩增等）虽然在某些方面表现出色，但难以同时支持蛋白质和核酸的高重检测、兼容多种检测模式并在临床样本中实现稳定、可重复的扩增。

酪酰胺信号放大（TSA）长期以来被广泛用于增强检测灵敏度，但传统上受限于可沉积分子的类型而多重检测能力有限。近期研究表明，条形码化的酪酰胺寡核苷酸可通过HRP催化沉积，实现高重成像，但多模态整合尚未得到验证。此外，HRP偶联寡核苷酸与荧光染料酪酰胺结合虽能放大抗体信号，但不可逆的共价荧光染料沉积限制了多重检测能力和样本重成像。

为系统性地解决上述挑战，Hendrik A. Michel、Paige McCallum及其合作者在Nature Methods上发表了题为“PASTA: versatile tyramide-oligonucleotide amplification for multimodal spatial biology”的研究论文，提出了一种名为PASTA（Protein and Nucleic Acid Serial Tyramide Amplification）的多功能信号扩增技术。

PASTA的核心原理是利用辣根过氧化物酶（HRP）催化酪酰胺-寡核苷酸共轭物在组织切片上的共价沉积。与传统荧光染料TSA不同，沉积的寡核苷酸条形码在组织上保持稳定，可实现延迟或重复成像，并与现有空间技术无缝整合。PASTA的工作流程如下：首先，通过偶联抗体（CODEX体系）结合靶标，然后通过寡核苷酸-HRP识别并结合到抗体条形码上，催化不同条形码的酪酰胺-寡核苷酸（B组）沉积，最后用荧光标记的互补寡核苷酸进行可视化。未扩增检测直接可视化A组条形码，而PASTA通过B组条形码实现信号放大——关键设计是A组和B组使用不同序列，因此PASTA不改变原始未扩增信号，可在同一组织上实现“先成像、后放大”的灵活策略。

PASTA展现出多项独特优势。信号增强可调——通过改变酪酰胺-寡核苷酸浓度实现可调灵敏度，对CD3和Iba1等标志物实现数量级信号提升。事后标记物“抢救”——在初始成像后，对表现欠佳的标志物（如CAIX和CD4）进行PASTA扩增，无需额外组织切片即可从珍贵临床样本中挽救原本不可用的数据。多模态兼容——PASTA整合了原位杂交（ISH）检测病毒DNA/RNA（SIV、EBV、SARS-CoV-2）、邻近连接分析（PLA）检测蛋白互作，以及偶联困难的抗体（通过非偶联一抗+HRP二抗途径），实现了真正的空间多组学。自动化高通量——在OpenTrons OT-2液体处理平台上开发了自动化流程，显著减少手动操作时间和批次差异。高重ISH扩展——通过探针剥离和重探，在同一FFPE切片上实现8个RNA靶标的多重检测，并同时进行蛋白共检测。

研究者通过B细胞淋巴瘤组织微阵列的综合验证，展示了PASTA-CODEX整合了7种额外标志物（ISH、偶联困难抗体和事后挽救标志物）后，与纯CODEX工作流程的细胞表型结果高度一致（R²=0.9874），证明PASTA不显著改变细胞注释结果。

二、算法原理介绍

PASTA本质上是一种化学信号放大与多重解码技术，而非传统意义上的“算法”，其技术原理围绕“HRP催化寡核苷酸沉积 → 序列编码扩增 → 循环成像解码”三个核心环节展开。

（一）HRP催化酪酰胺-寡核苷酸沉积。 核心化学反应基于TSA原理：HRP在H₂O₂存在下催化酪酰胺（tyramide）形成高反应性的自由基中间体，这些自由基与邻近蛋白质的酪氨酸残基发生共价偶联（约4-10 nm范围），将偶联的寡核苷酸条形码稳定地“写”到组织上。与传统TSA使用荧光染料不同，PASTA使用寡核苷酸作为“报告基团”。每个扩增循环包括：（1）用HRP-寡核苷酸（或生物素-寡核苷酸 + HRP-链霉亲和素）识别靶标；（2）加入酪酰胺-寡核苷酸进行10-20分钟沉积；（3）用含80% DMSO的剥离缓冲液化学剥离HRP-寡核苷酸（5分钟×2次），消除残余HRP活性。这个过程可重复进行（序列多路复用），每次沉积不同条形码，实现多次连续扩增而不互相干扰。

（二）双条形码编码策略。 在CODEX体系中，每个抗体偶联一个独特的寡核苷酸条形码（A组，约30-40 nt）。PASTA引入第二组条形码（B组，同样30-40 nt），通过HRP-寡核苷酸桥接A组和B组：HRP-寡核苷酸与A组条形码互补，HRP部分催化B组酪酰胺-寡核苷酸的沉积。关键设计在于A组和B组序列不同，因此PASTA扩增信号与未扩增信号在解码时使用不同的荧光报告探针，可在同一成像循环中区分，且不改变原始抗体条形码。这种双码设计允许对同一靶标进行“先看基线再看放大”的灵活分析。

（三）PASTA-CODEX整合工作流。 PASTA-CODEX通过以下步骤实现多模态整合：（1）常规CODEX染色——DNA条形码偶联抗体孵育过夜，固定，在微流控芯片上通过反复杂交-成像-剥离循环对A组条形码成像；（2）PASTA扩增——在同一组织上（事后，或在CODEX染色前进行自动化扩增），通过HRP-寡核苷酸桥连和酪酰胺-寡核苷酸沉积实现信号放大，B组条形码同样通过荧光报告探针成像；（3）ISH整合——RNAscope或DNAscope的HRP标记C1-C4探针经TSA（非偶联抗体）或PASTA（偶联抗体）显色；（4）非偶联抗体整合——用未标记一抗+HRP二抗，通过PASTA沉积条形码；（5）事后挽救——在初始成像后，对弱信号标志物进行化学剥离和重新沉积，实现“抢救”。所有图像通过VALIS配准，用MESMER分割细胞，PhenoGraph聚类注释，实现标准化空间蛋白-核酸共分析。

三、总结

PASTA是一种基于HRP催化酪酰胺-寡核苷酸沉积的多功能空间信号扩增技术，通过双条形码编码实现未扩增与扩增信号的独立检测，支持可调灵敏度、事后挽救、多模态整合（蛋白质、RNA、DNA、蛋白互作）和高重ISH扩展。其核心创新在于：将TSA的化学稳健性与寡核苷酸条形码的可编程性结合，在同一FFPE组织上实现信号扩增与多组学信息解码的灵活组合，且不影响后续细胞表型分析。PASTA在B细胞淋巴瘤TMA上整合了7种额外标志物，与纯CODEX结果高度一致（R²=0.9874），为从发现到临床转化的空间生物学研究提供了成本效益高、平台兼容性强且功能可扩展的技术方案。